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普通siRNA合成

产品简介

普通的siRNA oligo均由HPLC纯化,100%除去尚未配对的单链,价格便宜,质量上乘。研究者只需用包装盒内的通用缓冲溶液稀释后即可用e转染试剂进行后续实验。

实验方法

siRNA 转染

 

AsiRNA转染的方法

 

 

脂质体型转染试剂进行转染需要注重的几点

哺乳动物转染的常见方法有:磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、机械法(例如,显微注射和基因枪)、阳离子脂质体试剂,其中阳离子脂质体试剂转染法是目前最常用的转染方法。

·      转染试剂的用量

·         siRNA的用量 

·         转染时的细胞密度

·         转染时的操作顺序 

·         转染时的操作顺序 

 

·         细胞与转染试剂/siRNA复合物的温浴的时间

BLipofectamin2000 转染试剂

 

 

Lipofectamin2000的应用领域

选择最适合的转染试剂和转染条件,往往取决于不同的哺乳动物细胞类型和不同的核酸分子。 Lipofectamin2000适用于核酸的体内和体外操作,可应用于DNARNA、反义寡核苷酸、siRNA的转染,也可应用于DNA/siRNA 的共转染操作;是一种新型的高效siRNA转染试剂。

·         原代培养细胞和转化细胞株的基因转染

 

 

·         siRNA高通量转染试验

 

 

 

·         DNA转染;DNAsiRNA的共转染

 

 

 

·         核酸(siRNADNARNA)的体内导入试验

 

 

 

·         贴壁细胞和悬浮细胞转染

 

 

 

Lipofectamin2000 的特点:

 

不必更换培养基,操作简便易行,可在半小时内完成操作

 

在含血清培养基中也能表现高转染效率

 

细胞毒性低;适用细胞广泛

 

即用型试剂,可在含有抗生素的完全培养基中转染

 

基于脂质的转染试剂,确保没有RNAse活性

 

 可介导siRNA高转染细胞及体内siRNA的高效导入

CLipofectamin2000适用的细胞类型

  

Lipofectamin2000转染试剂可广泛应用于多种细胞系的DNAsiRNA转染如:

HeLa(
人颈部癌 细胞)MCF-7(人乳房癌细胞)Hep3B(人肝细胞癌细胞)COS-7(猴肾细胞)Neuro-2a(鼠神经母细胞瘤细胞)NIKS(人角 质化细胞)B16(鼠黑素瘤细胞)DLD-1(人结肠癌细胞)NIH/3T3(鼠胚胎成纤维细胞)HT-29(人结肠腺癌细胞)A549(人肺 癌细胞)CHO-k1(仓鼠卵巢细胞)293(腺病毒5 DNA转化的人胚胎肾细胞),SVRbag4细胞等。

 

 

 

 

 

D.转染前细胞培养

 

 

在细胞板上培养细胞时,应使细胞汇合在24小时内达到70-90%

 

细胞培养用品

表面积(mm2/孔)

细胞密度

培养基(μL /孔)

 

 

96孔板

50

1.5´104-5.0´104

100μL

 

 

48孔板

100

3.0´104-1.0´105

200μL

 

 

24孔板

200

8.0´104-2.0´105

500μL

 

 

12孔板

401

1.6´105-4.0´105

1.0 mL

 

 

6孔板

962

3.0´105-8.0´105

2.0 mL

 

 

35 mm

962

3.0´105-8.0´105

2.0 mL

 

 

60 mm

2827

1.0´106-2.5´106

6.0 mL

 

E.合适的lipofectamin2000用量

 

 

合适的siRNA(DNA)lipofetamin2000比例对核酸的高效转染有重要影响;我们推荐的 DNAlipofetamin200010.515ug:ul),siRNAlipofectamin2000 10.01-10.1pmolul)一般情况下,此范围内都可获得高的转染效率。

细胞培养用品

siRNA/DNA

培养基最终体积

Lipofectamin2000(siRNA/DNA)

 

96孔板

5pmol/0.2μg

100μL

0.25μl/0.5μl

 

24孔板

20pmol/0.8μg

500μL

1μl /2μl

 

12孔板

40 pmol /1.6μg

1 mL

2μl /4μl

 

6孔板

100 pmol /4.0μg

2 mL

5μl /10μl

 

35 mm

100 pmol /4.0μg

2 mL

5μl /10μl

 

60 mm

600 pmol /8.0μg

5 mL

10μl /20μl

 

 

F.贴壁细胞转染程序

  

 

 

转染前一天,4-5´104细胞接种在24孔板上, 0.5mLFBS和抗生素的DMEM(或Opti-MEM,其他培养基)细胞培养基。

 

 

  

选用生理状态良好的细胞对提高转染效率很

2 选择用于初期接种的细胞数量,应能在24小时内使细胞汇合达到70-90%

 

重要。siRNA(DNA)lipofectamin的用量和两者的比例可在推荐范围内适当调整。

 

 

50μlDMEM(或Opti-MEM,或其他无血清培养基)无血清培养基加入20pmol siRNA(0.8μg DNA),柔和混匀;

 

 

 

 

  

 

混匀lipofectamin试剂,用50μl无血清的DMEMOpti-MEM,或其他无血清培养基)稀释1μl lipofectamin试剂(DNA转染时,则加入2μllipofectamin试剂),轻轻混匀,室温放置5分钟;

 

 

  

 

将稀释好的siRNARNAi-Mate试剂混合;轻柔混匀,室温放置20分钟,以便形成siRNA/lipofectamin(或DNA/lipofectamin)复合物。

 

 

  

 

100μl siRNA/lipofectamin(或DNA/lipofectamin)复合物加到含有细胞和培养基的培养板的孔中,来回轻柔摇晃细胞培养板板。

 

 

  

 

7 细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后,进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感,孵育4-6小时后,除去复合物,更换培养基。  

 

G.悬浮细胞转染程序

  

 

 

转染的当天,收集细胞离心,用含FBS的培养基重悬。

 

 

  

 

50μlDMEM(或Opti-MEM,或其他无血清培养基)无血清的培养基加入20pmol siRNA(0.8μg DNA),柔和混匀;

 

 

  

 

混匀lipofectamin试剂,用50μl无血清的DMEMOpti-MEM,或其他无血清培养基)稀释1μl lipofectamin试剂(DNA转染时,则加入2μl lipofectamin试剂),轻轻混匀,室温放置5分钟;

 

 

  

 

将稀释好的siRNAlipofectamin试剂混合;轻柔混匀,室温放置20分钟,以便形成siRNA/lipofectamin(或DNA/lipofectamin)复合物。

 

 

  

 

再加入400μL细胞悬浮液(细胞数量决定于细胞类型和转染后分析测试的时间)。

 

 

  

 

6 细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后,进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感,孵育4-6小时后,除去复合物,更换培养基。  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

HDNAsiRNA共转染细胞

 

 

在转染的前一天,4-5´104细胞接种在24孔板上,0.5 mLFBS和抗生素的细胞培养基。

 

选择用于初期接种的细胞密度,应能在24小时内使细胞汇合达到70-90%

 

100μL的无血清的培养基中稀释20pmol siRNA0.2μg DNA,加入2μl lipofectamin试剂,充分混合,放置20分钟,以便形成siRNA/ DNA/lipofectamin复合物。

 

siRNA/ DNA/lipofectamin复合物加入培养基中,轻轻混匀。

 

5 细胞在37℃温育24h-48h后,进行转染后的其它步骤。

IsiRNA体内导入方法

 

 

适量的siRNADNA溶于不含RNA酶的无菌水中,轻轻混匀,因为注射液体积有限,建议采用高浓度的siRNADNA,一般DNA2μg /μLsiRNA10μg /μL

 

取适量的DNAsiRNAsiRNA\DNA复合物与lipofectamin混合。例如,在1#管中加入0.5μLDNA1μg)和 0.5μLsiRNA5μg),在2#管中加入0.55μLlipofectamin24μg)和0.45μL不含RNA酶的无菌水中,将1# 中的溶液加入2#管中,在室温下温育30分钟,以形成siRNA/DNA-lipofectamin复合物。

 

3 制备的siRNA/DNA-lipofectamine复合物可用于体内导入siRNADNAsiRNA\DNA

 

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