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慢病毒包装

慢病毒(Lentivirus载体是以HIV-1病毒为基础发展起来的基因研究载体,区别于逆转录病毒载体,它对于分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
典君生物的慢病毒系统属于第三代慢病毒系统,生物安全性高,采用VSVG包膜,宿主范围广泛,慢病毒滴度高,其病毒滴度可以达到10^9TU/ml
典君生物的慢病毒载体有CMVmCMVCAGPGKUbCEF1aGFAPNSE等多种启动子可供选择;而且还有EGFPZsGreentdTomatomCherryEYFP等多种荧光标记蛋白可供选择;抗生素筛选基因有PuromycinNeomycinHygromycin等可供选择。
典君生物可以提供非整合型慢病毒包装,在分裂细胞中瞬时表达,在非分裂细胞中可稳定表达,不会插入到宿主细胞基因组中,减少插入突变的风险;而且还可以提供诱导表达慢病毒的包装,如Tet-On系统等。

慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1病毒为基础发展起来的基因研究载体,区别于逆转录病毒载体,它对于分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
典君生物的慢病毒系统属于第三代慢病毒系统,生物安全性高,采用VSVG包膜,宿主范围广泛,慢病毒滴度高,其病毒滴度可以达到10^9TU/ml
典君生物的慢病毒载体有CMVmCMVCAGPGKUbCEF1aGFAPNSE等多种启动子可供选择;而且还有EGFPZsGreentdTomatomCherryEYFP等多种荧光标记蛋白可供选择;抗生素筛选基因有PuromycinNeomycinHygromycin等可供选择。
典君生物可以提供非整合型慢病毒包装,在分裂细胞中瞬时表达,在非分裂细胞中可稳定表达,不会插入到宿主细胞基因组中,减少插入突变的风险;而且还可以提供诱导表达慢病毒的包装,如Tet-On系统等。



腺相关病毒(adeno-associated virusAAV),也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属,是目前发现的一类结构简单的单链DNA缺陷型病毒,需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。

典君生物的腺相关病毒血清型种类齐全,可提供AAV1AAV2AAV3AAV4AAV5AAV6AAV7AAV8AAV9AAV-DJ10种血清型,而且还可以包装双链AAVscAAV)。

典君生物的腺相关病毒载体有CMVmCMVCAGPGKRK1EF1aGFAP等多种启动子可供选择;而且还有EGFPZsGreentdTomatomCherryEYFP等多种荧光标记蛋白可供选择;同时可以提供诱导型AAV病毒的包装,如Tet-On系统等。


10种不同AAV血清型对各组织器官细胞的亲嗜性

血清型

组织亲嗜性

AAV1

肌肉,心脏,骨骼肌(包括心肌),神经组织

AAV2

中枢神经,肌肉,肝脏,脑组织,眼,

AAV3

肌肉,肝脏,肺,眼

AAV4

中枢神经,肌肉,眼,脑

AAV5

肺,眼,中枢神经,关节滑膜,胰腺

AAV6

肺,心脏

AAV7

肌肉,肝脏

AAV8

肝脏,眼,中枢神经,肌肉

AAV9

心脏,肌肉,肺(肺泡),肝脏,中枢神经

AAV-DJ

视网膜,肝脏,肺,肾脏

 技术服务名称  

实验周期

病毒滴度、数量

基因过表达AAV病毒包装(可包装AAV1AAV9AAV-DJ血清型) ,基因大小≤1.5kb

34

1×1012vg5×1012vg

基因过表达scAAV病毒包装(可包装AAV1AAV9AAV-DJ血清型) ,基因大小≤1.5kb

34

1×1012vg5×1012vg

基因过表达AAV病毒包装(可包装AAV1AAV9AAV-DJ血清型) ,基因大小1 .5kb2.5kb

34

1×1012vg5×1012vg

基因过表达AAV病毒包装(可包装AAV1AAV9AAV-DJ血清型) ,基因大小2.5kb3.5kb

34

1×1012vg5×1012vg

ShRNA表达AAV病毒包装(可包装AAV1AAV9AAV-DJ血清型)

34

1×1012vg5×1012vg

ShRNA表达scAAV病毒包装(可包装AAV1AAV9AAV-DJ血清型)

34

1×1012vg5×1012vg

miRNA表达AAV病毒包装(可包装AAV1AAV9AAV-DJ血清型)

34

1×1012vg5×1012vg

miRNA表达scAAV病毒包装(可包装AAV1AAV9AAV-DJ血清型)

34

1×1012vg5×1012vg

对照AAV病毒包装(可包装AAV1AAV9AAV-DJ血清型)

23

1×1012vg/ml,200ul

对照AAV病毒包装(可包装AAV1AAV9AAV-DJ血清型)

23

5×1012vg/ml

对照scAAV病毒包装(可包装AAV1AAV9AAV-DJ血清型)

23

5×1012vg/ml

对照AAV病毒包装(可包装AAV1AAV9AAV-DJ血清型)

34

1×1013vg/ml

对照scAAV病毒包装(可包装AAV1AAV9AAV-DJ血清型)

34

1×1013vg/ml

临床级AAV病毒包装

78

5×1012vg/ml


腺病毒(Adenovirus)是一种没有包膜的直径为7090 nm的病毒颗粒,为线状双链DNA分子,约含35 000 bp,两端各有长约100 bp的反向重复序列。

典君生物的腺病毒为5型血清型腺病毒,缺失了腺病毒的早期表达基因序列E1区和E3区。E1是腺病毒复制所必须的,E1的缺失使其不能自身复制,只能依靠包装细胞如HEK293细胞提供的反式互补进行复制扩增,以此保证腺病毒的安全性。E3基因表达的蛋白能对抗宿主的抗病毒防御系统,E3区的去除能减少宿主的体内免疫反应。

典君生物的腺病毒包装采用的是AdMax系统,通过Cre-loxp重组酶,使共转染到HEK293细胞中的腺病毒载体穿梭质粒和骨架质粒(腺病毒基因组质粒)在重组酶的作用下产生重组腺病毒,获得的病毒滴度更高,其病毒滴度可以达到1012PFU/ml

典君生物的腺病毒载体有CMVmCMVCAGPGKUbCEF1a、等多种启动子可供选择;而且还有EGFPZsGreentdTomatomCherryEYFP等多种荧光标记蛋白可供选择。


技术服务名称

实验周期

病毒滴度、数量

基因过表达腺病毒包装,基因大小≤2kb

45

1×109pfu1×1010pfu

基因过表达腺病毒包装,基因大小≤2kb

56

1×1011pfu/ml

基因过表达腺病毒包装,基因大小2kb4kb

45

1×109pfu1×1010pfu

基因过表达腺病毒包装,基因大小2kb4kb

56

1×1011pfu/ml

基因过表达腺病毒包装,基因大小4kb5kb

45

1×109pfu1×1010pfu

基因过表达腺病毒包装,基因大小4kb5kb

56

1×1011pfu/ml

基因过表达腺病毒包装,基因大小>5kb

商定

1×109pfu1×1010pfu

ShRNA表达腺病毒包装

45

1×109pfu1×1010pfu

ShRNA表达腺病毒包装

56

1×1011pfu/ml

miRNA表达腺病毒包装

45

1×109pfu1×1010pfu

miRNA表达腺病毒包装

56

1×1011pfu/ml

对照腺病毒包装

45

1×1010pfu/ml,200ul

对照腺病毒包装

45

1×1010pfu/ml

对照腺病毒包装

56

1×1011pfu/ml

临床级腺病毒包装

78

1×1011PFU/ml

























逆转录病毒(Retrovirus)是一种RNA病毒,在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA转变为cDNA,再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。它的基因组有三个基因:gag-编码病毒的核心蛋白;pol-编码逆转录酶;env-编码病毒的被膜糖蛋白。逆转录病毒的DNA基因组整合在宿主染色体上的位点是随机的。逆转录病毒DNA的整合是复制病毒RNA的必经阶段。只有当受感染细胞处于细胞分裂期间,逆转录病毒DNA基因组才能接触到宿主细胞的遗传物质。因此,逆转录病毒只能在分裂中的细胞内复制(图1)。

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1 逆转录病毒作用机制

逆转录病毒用于分裂细胞特异性感染,表达稳定高效。逆转录病毒的亲嗜性存在物种之间的差异,据此可将其分为三类:

1)单嗜性逆转录病毒(ectropic retrovirus),只感染小鼠和少数几个品种的大鼠;

2)兼嗜性逆转录病毒(amphotropic retrovius),能感染小鼠的细胞,也能感染其他种属动物的细胞;

3)异嗜性逆转录病毒(xenotropic retrovirus),能感染多种动物细胞,但不能感染小鼠细胞。

目前使用较多的是兼嗜性逆转录病毒,即以兼嗜性包装细胞包装病毒颗粒。逆转录病毒的宿主范围由病毒颗粒表面的包被蛋白(Env)决定,病毒基因组不影响其靶向性,不同的基因组可用相同的Env包被,且Env来自何种病毒,包装出的病毒颗粒就叫该病毒的假病毒。

和元生物逆转录病毒的生产和质控采取了国际学术界公认的标准流程,采用三质粒系统在293T细胞中进行包装。所获得的病毒颗粒经过超速离心纯化,并通过qPCR对病毒滴度进行测定。一般情况下我们的逆转录病毒滴度在107~108TU/ml,完全可以满足各类实验的使用要求。

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典君生物可提供质粒转染和慢病毒感染两种稳转细胞株的构建方式,还可提供基因过表达、基因干扰以用各种荧光标记等稳定细胞株的构建。常用的真核表达载体的抗性素筛选基因有嘌呤霉素(puromycin)、潮霉素(hygromycin)和新霉素(neomycin)等。


技术服务名称

实验周期

规格

贴壁细胞多克隆稳转细胞株构建

45

1×106 Cells

贴壁细胞单克隆稳转细胞株构建

56

1×106 Cells

悬浮细胞多克隆稳转细胞株构建

56

1×106 Cells

悬浮细胞单克隆稳转细胞株构建

78

1×106 Cells


典君生物可提供基因过表达载体构建、RNAi基因沉默表达载体构建、microRNA表达与抑制载体构建以及基因定点突变载体构建等,而且还可以为客户量身定制各类表达载体。

典君生物自主研发的病毒(慢病毒、腺病毒、腺相关病毒)单质粒Tet-on系统,其构建好的质粒既可直接用于真核细胞表达,也可以包装相应的病毒后使用,其感染效率更高,目的基因诱导表达水平更强。同时含有EGFPZsGreentdTomatoEYFP等荧光标记蛋白、PuromycinNeomycinHygromycin等抗生素筛选基因,可直接用于稳转细胞株构建等。

典君生物可提供普通RT-PCRReal-time PCR检测技术服务,同时还可以提供无内素素质粒大提以及基因组DNA提取技术服务等。


技术服务名称

实验周期

载体构建,基因大小≤2kb

1

载体构建,基因大小2kb4kb

12

载体构建,基因大小4kb6kb

12

载体构建,基因大小>6kb

商定

基因突变,突变位点≤10bp

12

基因突变,突变位点10bp20bp

12

基因突变,突变位点>20bp

商定

全基因合成

24

1ShRNA表达载体构建

12

2ShRNA表达载体构建

12

3ShRNA表达载体构建

12

一个载体同时表达2ShRNA载体构建(2个不同的启动子)

23

一个载体同时表达4ShRNA载体构建(4个不同的启动子)

34

1条诱导型ShRNA表达载体构建

12

2条诱导型ShRNA表达载体构建

12

4条诱导型ShRNA表达载体构建

12

一个载体同时表达2条诱导型ShRNA载体构建

23

一个载体同时表达4条诱导型ShRNA载体构建

34

microRNA前体(pre-miRNA)表达载体构建

12

microRNA inhibitor表达载体构建

12

初始microRNApri-microRNA)表达载体构建

23

普通RT-PCR检测

12

常规Real-time PCR检测

12

Real-time PCR检测microRNA

12

质粒大规模提取服务(无内毒素)

1

动物细胞RNA提取

1

动物细胞基因组DNA提取

1

甲基化检测(BSP克隆测序法)

45

甲基化检测(MSP克隆测序法)

34

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