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自噬双标新品 :mCherry-GFP-LC3腺病毒(Adenovirus)、慢病毒(Lentivirus)和腺相关病毒(AAV)

一、自噬简介

1、大自噬(macroautophagy),也就是通常说的自噬(autophagy),是真核细胞蛋白降解的途径之一。自噬可以被描述为细胞质内的成分(细胞器、蛋白等)被双层膜的囊泡包裹,形成自噬体(autophagosome),进而传递到溶酶体进行降解的过程。

详细来说,自噬过程与内涵体途径(endolysosomal pathway)密不可分(见图1)。一方面,自噬体能够与晚期内体(late endosome)融合形成中间囊泡(amphisome)最终形成自噬溶酶体(autolysosome);另一方面,自噬体能够直接与溶酶体(lysosome)融合形成自噬溶酶体。无论通过哪条途径,自噬溶酶体最终通过酸性水解酶将细胞器、蛋白等消化分解。

细胞本底水平的自噬发生在营养充足的条件下,可保护细胞免受错误折叠蛋白或受损细胞器的影响,从而防止某些疾病的发生(如神经退行性疾病和癌症)。饥饿等也可诱导自噬的发生,通过降解大分子物质和细胞器为细胞活动提供营养和能量。

1 自噬过程及其与内涵体途径的关系

(Tom Egil Hansen and Terje JohansenBMC Biology2011)

2、自噬的调控

雷帕霉素靶蛋白(mTOR)激酶在自噬反应中起着重要的调节作用。mTORAkt and MAPK signaling)在被mTOR激酶激活后,自噬反应被抑制;而在mTORAMPK and p53 signaling)未被抑制后,自噬反应机制被启动。作为酵母中Atg1的同系物,三个相关的丝氨酸/苏氨酸激酶 UNC-51样酶-1-2-3ULK1, ULK2, UKL3),通过与mTOR复合物之间的相互作用来实现自噬反应。ULK1ULK2mAtg13和骨架蛋白FIP200(酵母Atg17的同系物)一起形成一个复杂的复合物。Class III PI3K复合物由hVps34, Beclin-1 (酵母 Atg6的同系物), p150 (酵母Vps15同系物), 和类Atg14蛋白 (Atg14L or Barkor) 或者紫外线放射抗性相关蛋白UVRAG (ultraviolet irradiation resistance-associated gene )蛋白组成,其在诱导自噬反应中起关键作用。Atg基因通过形成Atg12-Atg5 and LC3-II (Atg8-II)复合物来调控自噬体的形成。在Atg7Atg710(分别对应泛素活化酶E1和泛素结合酶E2酶)的作用下,Atg12Atg5之间通过一个类泛素反应结合形成Atg12-Atg5Atg12-Atg5再通过非共价键与Atg16结合形成多聚体Atg12-Atg5-Atg16,参与自噬体的扩张。在Atg4 Atg7Atg3的作用下,LC3转变为LC3-II-PE并紧密结合于自噬泡膜表面,参与前自噬体的延伸。

自噬既能抑制也能促进细胞凋亡,两种反应在生物体内广泛存在。在营养缺乏时,自噬反应作为一个细胞的促活反应机制存在,但是过量的自噬反应也会导致细胞死亡,但由自噬导致的细胞死亡与细胞凋亡在形态学上有明显的不同。几种促凋亡信号因子,如TNF, TRAIL, and FADD也会诱导自噬的反应发生。此外,Bcl-2也是自噬反应重要的调节因子,其为凋亡抑制蛋白,通过与Beclin-1结合形成复合物,来抑制由Beclin-1诱导的细胞自噬。

线粒体自噬属于选择性自噬,其主要作用是降解细胞中损伤以及不需要的线粒体。当线粒体损伤之后,在正常的线粒体中持续被降解的PINK蛋白(PARL促进此反应)会处于稳定状态,再通过E3连接酶Parkin的作用来诱导线粒体自噬。Parkin会诱导线粒体膜蛋白的聚泛素化,由此导致与LC3结合的自噬受体蛋白的SQSTM1/p62, NBR1, and Ambra1聚集。此外,在特定的细胞类型中,同样存在LC3结合区域(LIR)的BNIP3 BNIP3L/NIX直接通过泛素依赖型反应机制也会聚集自噬反应的相关因子,进而促进自噬体的形成。

 

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1 自噬体计数及自噬流检测方法汇总

Mizushima et al, Cell, 2010

其中,电镜观察法由于受到实验条件和设备的限制应用范围有限;而由于自噬过程发生快速,通过IB/WB检测LC3-II水平和GFP-LC3的方法易受到实验进行时长的影响。

想要准确检测自噬流的变化,需要多种技术手段共同使用,才能达到理想的实验效果,产生具有说服性的实验结果。

自噬双标产品 mCherry-GFP-LC3B腺病毒(Adenovirus)、慢病毒(Lentivirus)和腺相关病毒(AAV

mCherry-GFP-LC3B自噬双标系统的工作原理为: 未发生自噬的细胞及含有自噬体的细胞中,由于mCherryGFP共同表达,细胞呈现黄色荧光。当自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体后,酸性的溶酶体环境使酸敏感的GFP荧光淬灭,而mCherry不受影响,进而使自噬溶酶体呈现红色荧光。因此,红色荧光可指示自噬溶酶体形成的顺利程度。红色荧光越多,绿色荧光越少,则从自噬体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅。反之,自噬体和溶酶体融合被抑制,自噬溶酶体进程受阻(见图4和附图)。

Vigene现推出mCherry-GFP-LC3B腺病毒、慢病毒和腺相关病毒,满足您实验的不同需要。

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