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转录活性报告载体

转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子,也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合,这些特异性的序列被称为顺式作用元件,转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合,从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验(luciferase assay)是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。

实验原理:

构建一个将特定目的启动子片段插入到无启动子荧光素酶编码序列5‘端的报告基因质粒,如pGL3-basic等。

将待测转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子,则荧光素酶基因就会表达,荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。

加入特定的荧光素酶底物,荧光素酶与底物反应,产生化学发光,通过检测化学发光的强度可以测定荧光素酶的活性,从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段相互作用。



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